《自然医学》：免疫治疗全新靶点，即将改写PD-1的历史

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2018诺贝尔奖将医学奖授予了肿瘤免疫领域。在该领域中，陈列平教授做出了众多不可磨灭的贡献。2019年3月5日，著名期刊《自然·医学》刊登了耶鲁大学医学院陈列平团队的研究，发现了一个全新的、广泛存在于多种肿瘤中的免疫抑制分子Siglec-15。

简易版
陈列平团队发现了一个全新的、广泛存在于多种肿瘤中的免疫抑制分子Siglec-15（以下简称S15），它的表达水平与PD-L1的表达是互斥的。

研究人员使用高通量细胞表面分子筛选的方法，找到了能够调节T细胞活性的分子S15。通过体外细胞互作分析系统证实，S15在巨噬细胞上能够直接抑制T细胞活性。

更进一步的体外实验发现，敲除S15的小鼠的肿瘤生长降低，且使用S15单抗治疗后，可以抑制小鼠肿瘤生长。

以上结果提示S15是又一个在肿瘤微环境中参与免疫逃逸的分子，且有作为治疗靶标的潜力。

S15与PD-1
近年来，免疫疗法已经在癌症治疗上取得不小的成功，其中最有代表性的就是靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂。

尽管如此，PD-1/PD-L1抗体只对少于40%的实体瘤有作用，寻找能弥补PD-1/PD-L1抗体不足的新靶点迫在眉睫。

然而，晚期人类癌症的肿瘤微环境（TME）中的免疫逃避机制是高度异质的。大量证据表明，除了PD-1/PD-L1通路之外，许多其他分子或细胞机制也能导致TME中免疫功能失调。

这些机制包括但不限于：免疫细胞浸润不足、调节性T细胞的积聚、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓系来源抑制细胞(MDSCs)的存在，以及抑制性分子、细胞因子、代谢物的上调。

不过，有个问题是，上述的许多机制缺乏肿瘤微环境特异性，靶向这些途径可能会导致免疫系统的广泛激活，最终导致自身免疫疾病。

那么，在TME中，是否有其他类似PD-1/PD-L1的分子也能调节免疫反应从而调控肿瘤的发展？

陈列平教授团队发现的Siglec-15(S15)，给免疫治疗带来了新思路。

S15并不简单，它的表达水平与PD-L1的表达是互斥的。简单来说，对绝大多数肿瘤而言，有PD-L1高表达就没有Siglec-15；有Siglec-15高表达就没有PD-L1。

这就意味着，那些对PD-1/PD-L1抗体不响应的肿瘤，S15抗体可能就是新的希望。

S15的发现之路
筛选
为了找到新的肿瘤免疫调控分子，研究者使用高通量功能筛选系统(TCAA)，在体外实验中鉴定调节T细胞活性的细胞表面分子。这一系统包含6500多个人类基因，编码人类基因组中90%以上的跨膜蛋白。

TCAA原理示意图

系统搭建完成之后，研究人员首先用之前已经发现的T细胞激活或抑制蛋白，证实了这个系统的可靠性，然后开始大规模的筛选工作。

在多轮TCAA筛选后，将候选分子在后续体内和体外实验中进行全面分析。TCAA筛选得的候选分子中，有若干个已经被报道的分子，如共刺激(B7-1, B7-2, CD200, CD70)，凋亡(FASL, TRAIL, GZMB)或共抑制(KLRD1, BTN3A3等)。

在这些候选者中，S15脱颖而出，可以持续抑制T细胞的活性。

蛋白序列分析显示，S15与B7-H基因家族(B7家族在肿瘤治疗、器官移植和自体免疫病的治疗方面有重要作用)有超过30%的同源性。S15与B7基因家族有着密切的关系，并可能与B7家族成员一样，具有免疫调节功能。

TCAA筛选结果示意图

抑制
Siglec-15在大多数正常人体组织和各种免疫细胞亚群中mRNA水平很低，但在巨噬细胞中有较高表达。研究者利用体外细胞互作分析系统证实，S15在巨噬细胞上能够直接抑制T细胞活性。

Siglec-15在人类组织细胞的mRNA水平分布

为了进一步鉴定其功能，研究者构建了S15全身敲除小鼠 (S15KO)，对S15KO小鼠长达18个月的观察显示，该类小鼠没有表现出明显的疾病表型，它们的体重、淋巴器官重量和血清抗核抗体都在正常范围内。这表明，S15对小鼠发育或免疫系统稳态并不重要。

互斥
同时，研究人员还利用TCGA数据库的数据，做了个Meta分析。结果显示，S15 mRNA在众多癌症中表达上调，包括肺癌、肾癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌等。

在241个人非小细胞肺癌（NSCLC）样本中，通过免疫组化分析，研究人员发现S15可以在肿瘤相关的基质细胞或肿瘤细胞，以及肿瘤浸润的巨噬/髓系细胞上检测到。

Siglec-15与PD-L1的表达相关性分析
更有趣的是，研究人员发现PD-L1的表达与S15的表达之间没有相关性，只有7/218(3.2%)的患者呈双阳性。这表明，二者之间可能是互斥的关系，靶向S15的药物，有可能恰好是PD-1/PD-L1抗体的有力补充。

通过分析，研究人员发现阻断S15之后，肿瘤中的CD8阳性T细胞和自然杀伤细胞显著增加，而Treg、CD4阳性的T细胞，以及自然杀伤T细胞和B细胞没有增加。还有一些免疫抑制细胞有所减少。而且，CD8阳性T细胞的IFN-γ等细胞因子的产生能力也显著提升。

如果用特异性抗体去除CD8阳性T细胞的话，那么阻断S15对肿瘤的生长就不会有任何影响了。

以上数据证明，阻断S15可以让肿瘤微环境的免疫正常化，且不会引起严重的自身免疫反应。

抑癌
为了进一步探究S15在肿瘤治疗中的潜力，使用杂交瘤技术制备了S15特异性单克隆抗体 (α-S15)。

由于S15在人类癌症中有独特调节机制和表达分布，它在免疫调节中与B7-H1/PD-1途径无关。无论是否存在PD-1阻断抗体( Nivolumab )，α-S15都能有效促进人外周血T细胞产生细胞因子。

同时，α-S15和抗PD-1单克隆抗体作为单药使用时，能适度抑制肿瘤生长，但两种单克隆抗体的合并治疗能有更佳的疗效，在一些小鼠中肿瘤出现完全消退。

α-S15和抗PD-1单克隆抗体对肿瘤生长的影响

总结
Siglec-15（S15）是一个具有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点：

第一，S15在正常组织中的表达有限，S15缺陷对小鼠的正常生理影响极小，表明S15不是正常器官和组织生存和生长的必要分子，这可能是S15阻断疗法安全性基础。

第二，S15在TAMs和肿瘤细胞中上调，但在正常组织中不上调，表明Siglec-15的作用局限于TME，这为选择性靶向抗体治疗提供了条件。

第三，使用S15缺陷小鼠进行的肿瘤模型研究表明，S15对肿瘤部位的T细胞反应具有强大的免疫抑制作用，

第四，S15特异性单克隆抗体能够逆转T细胞抑制并在多种肿瘤模型中抑制肿瘤生长。

S15这种免疫抑制分子的发现，对目前无法使用抗PD-1治疗的癌症患者而言，多了一种希望。

对于肿瘤免疫治疗领域，陈列平教授曾在一次外媒采访中如此评价，“在接下来的5年里，我期待着出现与PD-1/PD-L1疗法相当或更好的发现。这已经初露端倪。”

值得一提的是，在2018世界生命科学大会上，陈列平教授宣布针对S15的临床实验已经开展，将在包括非小细胞肺癌、卵巢癌在内的多种实体瘤中进行Ⅰ/Ⅱ期临床研究，我们期待捷报的到来。